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巴氏杀菌机的工作原理主要包括预热阶段、加热阶段、保持阶段、冷却阶段，以及无菌灌装（针对UHT处理）。
预热阶段：巴氏杀菌机内的介质（通常是水）被加热到一个预设的温度，这个温度根据不同的食品类型和所需的杀菌程度而变化，一般在60℃至90℃之间。
加热阶段：待处理的食品（如牛奶、果汁或其他液态食品）被连续或间歇地送入巴氏杀菌机。加热可以通过直接蒸汽注入、热交换器（如板式、管式）或浸入热水中进行，温度通常会升至75℃至90℃，对于某些高强度的巴氏杀菌（如UHT处理），温度可能高达138℃至150℃。
保持阶段：一旦达到目标温度，食品会在该温度下保持一段时间，称为保温时间。这段时间从几秒钟到几十分钟不等，具体取决于食品类型和所要达到的杀菌效果。例如，“低温长时间"处理可能持续数十分钟，而“高温短时间"处理仅需几秒钟。
冷却阶段：为了防止在处理后因残留热量导致的继续加热和可能的微生物再生长，以及为了保持食品品质，完成加热和保温后，食品会被迅速冷却。这通常通过引入冷水循环或使用冷风来进行，直至产品温度降至安全储存或后续包装所需的温度。
无菌灌装（针对UHT处理）：对于超高温瞬时杀菌（UHT）处理，产品在无菌条件下迅速灌装于无菌包装容器中，以维持商业无菌状态，延长保质期。
巴氏杀菌机的设计多种多样，可以是静态罐式、连续带式或使用热交换器的连续流动系统，每种设计都适用于不同类型的食品处理需求
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